e-Περιοδικό Επιστήμης & Τεχνολογίας

e-Journal of Science & Technology, (e-JST)

INTEGRATED REAL-TIME PCR FORMATS: METHODOLOGICAL ANALYSIS AND COMPARISON OF  TWO AVAILABLE INDUSTRY OPTIONS

Manousos E. Kambouris, PhD

Dept of Medical Laboratories,  Fcty of Health and Caring Professions, Technological Educational Institute (TEI) of Athens, Ag Spyridonos st., 12210 Athens, GREECE.

Abstract

The real-time PCR methodology improved profoundly the basic amplification technology; not only by permitting the digital tracking of the reaction from the very first minutes, but also by significantly compressing the time for an amplification program, through technical improvements in expendables and hardware. Two of the integrated, end-to-end solutions available in the market, the Roche and the Applied Biosystems products, also capitalize on the advances at the multi-color dyes and the melting-curve analysis to perform products discrimination and dispose of post-amplification steps, such as electrophoresis, thus further compressing time and logistics footprint of the integrated assay. They also focus on the well-proven ability of the methodology to provide accurately quantitative results, which was always a priority throughout the field of biosciences, and one rarely tackled efficiently. Electrophoresis, though, remains popular with low-end users, who find it robust, reliable, flexible and relatively cheap since expendables are low-cost and know-how is well-established. Given that high-end users prefer true high-throughput methods (such as arrays) for simultaneous assaying, which vastly outperform real-time PCR, the ease and rapidity of the latter’s results, which both are of capital diagnostic concern, remain the strongest points of the method, coupled with its quantification potential.

Key words: Real-time PCR, FRET pairs, SYBR-Green,  post-amplification procedure, DNA quantification

 ---------------------------------

ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΕΣ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΑΝΑΓΝΩΣΗΣ: ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΔΥΟ ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΔΙΑΘΕΣΙΜΩΝ ΕΠΙΛΟΓΩΝ

Δρ. Μανούσος Εμμ. Καμπούρης

Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας-Πρόνοιας, ΑΤΕΙ Αθηνών, Αγ. Σπυρίδωνος, Αιγάλεω 12210.

Περίληψη

Η PCR Πραγματικού Χρόνου Ανάγνωσης επέτρεψε την πολυδιάστατη βελτίωση της βασικής τεχνικής ενίσχυσης πυρηνικών οξέων. Αν και μεγάλη σημασία δίνεται την παρακολούθηση της αντίδρασης εν τω γενάσθαι,  που επιτρέπει εντός ελαχίστων λεπτών την δυαδική αξιολόγηση της αντίδρασης ως θετικής ή αρνητικής, τα πλεονεκτήματα εκτείνονται πέραν και ανεξαρτήτως αυτού του βασικού γνωρίσματος. Η βασική αρετή της είναι η συμπίεση του χρόνου εκτέλεσης πρωτοκόλλων ενίσχυσης στο 20% των συμβατικών μηχανημάτων, χάρη στην βελτιωμένη σύνθεση αντιδραστηρίων, την προηγμένη κατασκευή θερμικών κυκλοποιητών και την βελτιστοποίηση περιεκτών και σωληναρίων αντίδρασης, που επιτρέπουν ταχύτατες μεταβολές της θερμοκρασίας με ομοιογενή τρόπο. Δύο από τις ολοκληρωμένες λύσεις που εμφανίστηκαν στην αγορά ήταν  τα συστήματα της Roche και της  Applied Biosystems. Και τα δύο βασίζουν την προώθησή τους περισσότερο στην δυνατότητα εξάλειψης μεταενισχυτικού σταδίου ανάγνωσης, στις δυνατότητες ποσοτικοποίησης των προϊόντων και στην ικανότητα διάκρισης μεταξύ διαφορετικών προϊόντων για πολυπλεκτικές ή διαζευκτικές εφαρμογές σε ένα στάδιο. Οι δυνατότητες αυτές παρέχονται από την τεχνολογία ανάλυσης καμπύλης τήξεως και τις νέες, προηγμένες και αυξημένης ευκαμψίας τεχνολογίες χρώσης. Καθώς η διακριτική ικανότητα παραμένει ιδιαίτερα χαμηλή στην εποχή των συστοιχιών και των μεθόδων υψηλού ρυθμού συνεπεξεργασίας και η κατάργηση της ηλεκτροφόρησης δεν ελκύει πολλούς από τους λιγότερο εύρωστους χρήστες που έχουν αποκτήσει υποδομή και ικανοποιητική τεχνογνωσία σε αυτή τη μέθοδο, η εμπορική προοπτική των εν λόγω προσεγγίσεων προφανώς θα στηριχθεί στην εξαιρετική ταχύτητά τους, πολύτιμη για διαγνωστική χρήση, και στην δυνατότητα ακριβούς ποσοτικοποίησης που έχει εφαρμογές σε όλο το φάσμα των βιοεπιστημών.

Λέξεις-κλειδιά: PCR πραγματικού χρόνου ανάγνωσης, SYBR-green, διώνυμες χρωστικές FRET, ποσοτικοποίηση προϊόντος PCR

[return]